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    【教程】構(gòu)建載體其實(shí)一點(diǎn)也不難!

    發(fā)布時間: 2021-08-26  點(diǎn)擊次數(shù): 2026次

    我們在研究基因的功能時,逃脫不掉的就是為了我們的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赡苄枰獦?gòu)建各種載體,比如表達(dá)載體,克隆載體,基因打靶載體等等。很多人在構(gòu)建載體的時候都感覺很困難,特別是對于一個剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室的新人來說那更是難上加難,*摸不著頭腦。

    那是因?yàn)槠鋵?shí)構(gòu)建載體是一個不小的工作量,需要經(jīng)歷很多的過程,比如首先我們需要設(shè)計(jì)引物引入酶切位點(diǎn),接下來還需要經(jīng)歷酶切酶連等過程,只要其中的某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題,那最終都會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

    構(gòu)建載體最關(guān)鍵的一步就是設(shè)計(jì)引物引入酶切位點(diǎn),一旦引物設(shè)計(jì)好,那接下來就非常簡單了,今天重點(diǎn)就來教教大家如何利用 snapgene 輕松獲得構(gòu)建載體所需的引物序列。 

    1. 打開軟件,選擇第一個(紅線標(biāo)記),然后輸入基因的 CCDS 序列(基因的 CCDS 序列可在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中獲得)


    【教程】構(gòu)建載體其實(shí)一點(diǎn)也不難!

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    2. 點(diǎn)擊 ok 后界面如下,圖中顯示的是會切割基因編碼序列的酶


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    3. 接下來點(diǎn)擊最上面的 Enzymes Noncutters,會顯示所有不會切割基因編碼序列的酶,這些酶都是我們可以用的,選酶的標(biāo)準(zhǔn):要選擇不能切割目的基因序列并且質(zhì)粒上含有的酶,還有就是最好是實(shí)驗(yàn)室有的酶。

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    4. 確定了可以用的酶后,接下來需要確定設(shè)計(jì)引物時用的這兩種酶,確定方法:這兩種酶最好不要鄰近,最好使用雙酶切有共同 buffer 的酶,兩個酶切位點(diǎn)最好不要是同尾酶(切下來的殘基不要互補(bǔ)),否則效果相當(dāng)于單酶切。 


    5. 確定了所要用的酶之后,接下來需要做的就是設(shè)計(jì)引物并引入酶切位點(diǎn)(注意:一定要看清楚載體上 promoter 的方向,將 CDS 正向插入到 promoter 后面) 


    6. 點(diǎn)擊左下角的 sequence,然后拉取上游一部分基因本身的序列,拉取的時候會顯示拉取的堿基的個數(shù)以及 Tm 值,拉取到 Tm 值 55 度左右就可以(55 度以上最好)

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    7. 然后點(diǎn)擊 primer——add primer,選擇 top strand


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    8. 點(diǎn)擊 insertions,在 site 位置處選擇你準(zhǔn)備引入的酶,比如我要引入 EcoR I,那我就選擇它,然后點(diǎn)擊 insert,這樣我們就引入了該酶的酶切位點(diǎn)。


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    9. 接下來需要添加保護(hù)堿基,一般所有的酶的保護(hù)堿基都加三個,加哪個堿基沒有要求,使 GC 含量及 Tm 值適中即可。


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    10. 這樣上游引物就設(shè)計(jì)好了,接下來需要檢測一下引物是否會形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),可以應(yīng)用 OligoCalc,如果發(fā)現(xiàn)會形成發(fā)卡結(jié)構(gòu),那就需要對引物序列做出一些調(diào)整,直到發(fā)卡結(jié)構(gòu)消失。 


    11. 接下來拉取基因的下游的一部分序列,用同樣的方法設(shè)計(jì)好下游引物,有一點(diǎn)需要注意的是,設(shè)計(jì)下游引物的時候選擇 bottom strand。 


    這樣構(gòu)建載體所需的引物就設(shè)計(jì)好了,怎么樣,是不是感覺其實(shí)也沒有那么難,接下來就可以構(gòu)建屬于你自己的載體了。

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