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    用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸標記哺乳動物細胞的方法

    發(fā)布時間: 2021-11-08  點擊次數(shù): 2114次
    材料與儀器

    細胞
    培養(yǎng)基

    實驗步驟

    1. 制備活躍生長著的細胞。從單層培養(yǎng)細胞(約鋪滿 75% 表面積)中吸去培養(yǎng)基。用預熱至 37℃ 的無血清培養(yǎng)基沖洗兩次(培養(yǎng)基中應該不含蛋氨酸和半胱氨酸)。對于懸浮培養(yǎng)細胞,通過 400 g 離心 5 分鐘收集細胞。用頂熱至 37℃ 的無蛋氨酸培養(yǎng)基重懸沉淀,400 g 離心 5 分鐘。盡可能地去掉上清,用無蛋氨酸培養(yǎng)基重懸細胞至 107 細胞/ml 后轉移至一塊小培養(yǎng)板。

    2. 加入預熱的無蛋氨酸和半胱氨酸的培養(yǎng)基,于 37℃ 培養(yǎng) 20 分鐘,以耗盡胞內(nèi)含硫氨基酸庫。

    3. 吸去培養(yǎng)基,立刻換上預熱的、無蛋氨酸和半胱氨酸何含有適量標記氨基酸的新鮮培養(yǎng)基,依據(jù)預實驗結果,將細胞于 37℃ 培養(yǎng)一定時間(對于末做過預實驗的蛋白質,以 2~4 小時作為初始值比較合適)

    4. 移去放射性培養(yǎng)基。對于單層培養(yǎng)細胞,吸出即可。懸浮培養(yǎng)細胞則可轉至試管,400 g 離心 5 分鐘,倒去上清。

    5. 準備一塊凍至 0℃ 的平板(如放在冰盒上的鋁板),將單層細胞培養(yǎng)板放上去。用冰冷的 PBS 沖洗兩次,沖洗液都到進放射性廢料桶。懸浮培養(yǎng)細胞用 PBS 重懸,400 g 離心 5 分鐘,倒去上清。

    6. 抽干細胞上殘留的 PBS,裂解細胞。


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