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從狗的胰臟中制備粗微體
發(fā)布時間： 2021-11-17 點擊次數(shù)： 1040次材料與儀器
胰臟
HM 緩沖液 蔗糖-緩沖液 三乙基氨基乙酸緩沖液步驟
1. 從動物身體切下胰臟，立即用大約 50 ml 冷 HM 緩沖液沖洗，放置于干凈的紙巾上，去除結(jié)締組織：
勻漿介質(zhì)（HM）
0.25 mol/L 蔗糖-緩沖液A
緩沖液A：
50 mmol/L 三乙基氨基乙酸緩沖液（TEA），pH 7.5
50 mmol/L KOAc
6 mmol/L Mg (0Ac)2
1 mmol/L EDTA
0.5 mmol/L PMSF
貯存液：
1 mol/L 三乙醇氨緩沖液，pH 7.5
4 mol/L KOAc，pH 7.5
1 mol/L Mg (OAc)2
PMSF：100 mmol/L 溶于 DMSO
2. 稱量胰臟的重量，置于干凈的玻璃盤里，用剃須刀片將其切成盡可能小的碎片。
3. 將切碎的胰臟過組織壓碎器并在 4 倍體積的 HM 中用馬達(dá)帶動的 Potter-Elvehjem Teflon 勻漿器勻漿，將勻漿器的管子保持在冰水中。
4. 用 Sorvall HB-4 轉(zhuǎn)頭或 SS34 轉(zhuǎn)頭在 Sorvall 冷凍離心機(jī)（DuPont Instrumcm) (最大 1000 g）中 4℃ 3200 r/min 離心 10 分鐘以去除細(xì)胞核、一些線粒體和未破碎的細(xì)胞。
5. 在同樣的轉(zhuǎn)頭（平均 10000 g）中 4℃ 10000 r/min 離心上清（后細(xì)胞核上清）10 分鐘以去除線粒體和溶酶體。
6. 用注射器和針頭將上清（后線粒體上清或 PMS ) 小心轉(zhuǎn)移，避免取疏松的那一層。
7. 在 Ti60 轉(zhuǎn)頭的離心管中鋪 18 ml PMS 于 6 ml 1.3 mol/L 蔗糖-緩沖液A ( PMS 與墊層的比例大約為 3:1）上，44000 r/min ( 最大 200000 g）離心 2.5 小時。
8. 用吸管去掉上清，包栝墊層溶液、界面的膜物質(zhì)和疏松層。
9. 用 Kimwipe 紙巾輕擦離心管的內(nèi)壁，用 Dounce 勻漿器通過 2 到 3 次上下杵擊將沉淀重懸于小體積的 0.25 mol/L 蔗糖-緩沖液 B中（1 g 組織中提取的微體約用 0.5 ml 緩沖液）。
緩沖液 B：
50 mmol/L TEA
1 mmol/L EDTA
10. 取 10 μl 與 1 ml 0.1％ SDS 溶液混合，測定 260 nm 和 280 nm 的光吸收值，用同樣的緩沖液將微體的濃度調(diào)節(jié)到 50 A280 nm/A280 nm 的值約為 1.9。從 1 g 組織中大約獲得 50 A280 nm 單位的粗微體。
11. 分裝粗微體懸浮液，在液氮中冷凍并保存在 -70℃。
12. 進(jìn)一步用 EDTA 處理粗微體以增加轉(zhuǎn)運活性，用凝膠過濾來減少微體在麥胚翻譯系統(tǒng)中的抑制作用，或用核酸酶來降低本底。 EDTA 的處理是這樣的：
(1) 將粗微體與等體積的 0.25 mol/L 蔗糖、50 mmol/L TEA 和 50 mmol/L EDTA 溶液混合。
(2) 將化合物 0℃ 保溫 15 分鐘。
(3) 在含有 0.5 mol/L 蔗糖、50 mmol/L TEA 溶液的 Ti60 離心管中鋪上保溫過的樣品（樣品與墊層的比例大約為 3：1），44000 r/min ( 最大 200000 g ) 離心 60 分鐘。
(4) 用吸管或注射器取出上清，用干凈的 Kimwipe 紙巾輕擦離心管內(nèi)壁。
(5) 用與起始粗微體體積相等的 0.25 mol/L 蔗糖、50 mmol/L TEA 和 1 mmol/L DTT 溶液重懸沉淀，用 Dounce 勻漿器輕輕勻漿。分裝懸浮液，在液氮中冷凍并保存在 -70℃。
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