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冷胰蛋白酶解離組織
發(fā)布時(shí)間： 2022-12-09 點(diǎn)擊次數(shù)： 1482次原理
剪碎的組織放在胰蛋白酶中于4°C 放置16~18h ，去除胰蛋白酶后溫育并于溫培養(yǎng)基中分散細(xì)胞。
材料與儀器
組織 DBSS 粗制胰蛋白酶
生長(zhǎng)培養(yǎng)基 皮氏平皿
培養(yǎng)瓶 鑷子 移液管 錐形瓶 剪刀 冰浴步驟
1. 將組織（1~5 g，預(yù)先稱(chēng)重）移入加有新配制的無(wú)菌 DBSS 的皮氏培養(yǎng)皿中，清洗。
2. 轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)皿中，切除多余組織如脂肪和壞死組織。
3. 轉(zhuǎn)入第三個(gè)培養(yǎng)皿中，用交叉的手術(shù)刀細(xì)切成大約 3 mm3 的小塊。胚胎的器官若小于 3 mm3 ，可全部保留。
4. 用彎鑷子將組織塊移入一個(gè)預(yù)稱(chēng)重的 15 ml 或 50 ml 無(wú)菌離心管內(nèi)。
5. 讓組織塊沉降。
6. 用 DBSS 重懸清洗組織塊，沉降后去除上清，重復(fù)此步驟兩次以上。
7. 小心去除剩余液體，預(yù)先稱(chēng)重。
8. 每克組織加入 10 ml 溶于 RPMI1640 或 S-MEM 的 0.25 % 胰蛋白酶（0.25 粗制胰蛋白酶溶于無(wú)血清的 RPMI1640或 MEM/Stirrer salt (S~MEM ) 中），置于 4°C 。
9. 4°C 放置 6~18 h 。
10. 小心吸去胰蛋白酶，余下組織及殘余胰蛋白酶（若需要，此時(shí)可加人 1~2 ml 其他酶，如膠原酶、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶等）。
11. 37°C 放置 20~30 min 。
12. 加入溫培養(yǎng)基，大約每 100 mg 初始的組織加 1 ml，輕輕上下吸打混合物至組織完-全分散開(kāi)。
13. 若部分組織未分散，細(xì)胞懸液可用無(wú)菌的平紋紗布或不銹鋼篩（100~200 μm )，或一次性使用的塑料篩濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，或者讓大的組織塊沉降。當(dāng)有較多組織時(shí)，可于每克組織中多加入 20 ml 培養(yǎng)基促進(jìn)沉淀和隨后的懸液收集，通常 2~3 min 就足以去除大多數(shù)的大塊組織。
14. 用血球計(jì)數(shù)板或電子計(jì)數(shù)儀測(cè)定懸液的細(xì)胞密度，檢査活細(xì)胞比率。
15. 細(xì)胞群體為異源性，由于校準(zhǔn)口徑較困難，因而初次使用電子計(jì)數(shù)儀時(shí)，需要用血球計(jì)數(shù)板來(lái)確認(rèn)。
16. 將細(xì)胞懸液生長(zhǎng)培養(yǎng)基（生長(zhǎng)培養(yǎng)基（如DMEM/F12，含10% 胎牛血清））稀釋?zhuān)姑亢辽囵B(yǎng)基含有 1×106 個(gè)細(xì)胞。按照需求接種于多個(gè)培養(yǎng)瓶（25 cm2、75cm2 培養(yǎng)瓶）中，大約每平方厘米為 2×105 個(gè)細(xì)胞。當(dāng)存活率不明確或難以預(yù)知時(shí)，細(xì)胞計(jì)數(shù)便無(wú)價(jià)值（如腫瘤活檢時(shí)，死亡細(xì)胞的比例很高）。在這種情況下，建議按每毫升 5~25 mg 組織的濃度接種。
17. 間隔一定時(shí)間更換一次培養(yǎng)基（2~4 天，以 pH 下降為標(biāo)準(zhǔn)）。由于部分細(xì)胞黏附較慢甚至易于懸浮生長(zhǎng)，所以丟棄上清前要先檢査上清液中是否有存活的細(xì)胞。以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。
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