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    永生化人腦微血管內(nèi)皮細胞(HCMEC/D3)培養(yǎng)指南

    發(fā)布時間: 2024-02-19  點擊次數(shù): 743次

    簡介:

     HCMEC/D3細胞系來自于癲癇患者手術切除的富含腦內(nèi)皮細胞(CECs)的組織,并從中分離出人顳葉微血管。后續(xù)使用人端粒酶(hTERT)和SV40大T抗原的催化亞基通過慢病毒載體轉導,使細胞依次永生化后,通過有限稀釋克隆法選擇性分離CEC,最終鑒定所得的細胞,具有廣泛的腦內(nèi)皮細胞表型特征??杀磉_大量內(nèi)皮細胞;可在基質膠上形成毛細血管樣結構;可作為人血腦屏障(BBB)模型。可用于研究內(nèi)皮細胞,血管,藥物攝取與主動轉運機制等。


    培養(yǎng)條件:

     內(nèi)皮細胞專用基礎培養(yǎng)基-EMC培養(yǎng)基+5%FBS+1%內(nèi)皮細胞生長添加物和1%青霉素/鏈霉素溶液。置于37°C,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。


    消化(10cm皿為例):

    1. 當單層培養(yǎng)細胞匯合達80%。

    2. 棄去舊培養(yǎng)基,2mlPBS潤洗兩次。

    3. 用1ml含0.25%ETDA的胰蛋白酶消化1-2min(在培養(yǎng)箱放1min,然后鏡下觀察變圓)。

    4. 用1ml(血清)細胞培養(yǎng)基終止消化,九宮格法吹落細胞收集到離心管,以800-1000rpm,室溫離心5min。


    傳代:

    以1:2~1:3的比例傳代,離心棄去廢液,用2ml~3ml(血清)細胞培養(yǎng)基充分重懸細胞沉淀成單個細胞,以“"Z“"字打入含有7ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中,輕柔十字晃勻不超過十下并靜置數(shù)分鐘后鏡下觀察,平穩(wěn)放入培養(yǎng)箱中。


    凍存:

    1. 凍存液的配置為血清:二甲基亞(DMSO)=9:1。

    2. 取長勢良好,匯合度達80%-90%并無污染的細胞,消化離心后用1.5ml凍存液重懸后轉移至凍存管中,標記好細胞種類、日期、操作者,放入恢復室溫的梯度凍存盒,一同放置于-80°C冰箱。


    復蘇:

    準備好離心管中放入3ml(血清)細胞培養(yǎng)基,并確保水浴鍋打開并達到37°C,從-80°C冰箱取出目標凍存管,放入密封袋并在水浴鍋中迅速搖晃解凍<1min,與3ml培養(yǎng)基混合均勻。在1000rpm,離心5分鐘,棄去上清液,用新培養(yǎng)基重懸細胞為單個細胞狀態(tài),加入10cm皿中,培養(yǎng)過夜。


    注意事項:

    1.ECM細胞培養(yǎng)基又稱內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基,是專門為人類微血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)設計的最合適其生長的(血清)細胞培養(yǎng)基,包括必需和非必需氨基酸、維生素、有機和無機化合物、激素、生長因子、微量礦物質和低濃度胎牛血清(5%)。


    2.該培養(yǎng)基的配方能夠選擇性的促進正常人類微血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)中的增殖和生長。


    3.嘗試過使用DMEM(高糖)培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基,考慮可能由于不含生長因子,多代后細胞形態(tài)發(fā)生改變,碎片增多。


    4.ECM細胞培養(yǎng)基中的數(shù)種成分是怕光的,所以推薦培養(yǎng)基不要長時間暴露在光中。避光4°C保存,配好的培養(yǎng)基需要在一個月內(nèi)使用。


    5.HCMEC/D3細胞十分耐造,正常培養(yǎng)即可。


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